9I制作厂

生物医学研究领域的荧光显微镜通常关注一系列不同颜色发射的相关性。不同的颜色代表特定染色的结构或代谢参数。生物学是研究生物体的科学，而生物体即使在微观尺度上也在运动。这一事实不仅适用于快速移动的原生动物，也适用于被认为是静态的个体，如植物。细胞区室、蛋白质和代谢分子通常用不同颜色的荧光标记物进行标记。多光子显微镜增加了其他选项，如二次和叁次谐波生成。这些颜色通道最好是同时记录，即并行记录，以保持它们在高度动态变化的环境中的相关性。通过这种方式，同时记录保留了被研究生物参数之间的时间和空间相互关系，并且提高了时间分辨率。这需要多个光传感器用于不同的颜色通道，这些传感器并行工作，并同时提供相关光谱的光的分数。

替代方案是顺序记录，其中为不同的光谱分数提供一个单一传感器，依次记录每个分数的图像并随后迭加。使用顺序方法，不仅可能会丧失空间和时间的相关性，而且时间分辨率也降低，降低的幅度至少等于记录参数的数量。因此，整个数据采集所需的时间要长得多：按相同的比例。

同时记录光谱发射分数的经典解决方案是使用二色光束分割镜和阻挡滤光片的排列。这种设计的缺点是，对于更改的染料组合，系统必须提供适当的滤光配置，使其成为一种成本高、速度慢且不灵活的解决方案。

对于单通道系统，这种不灵活性通过使用光谱设备——光谱仪被消除了。1997 年，徕卡激光技术公司推出了第一款具有自由可调检测通道的多通道光谱设备，允许共聚焦显微镜同时记录不同颜色的图像：SP 探测器。^[1]

该 SP 探测器解决方案用于共聚焦显微镜，采用一个棱镜将检测光分成其光谱成分，并通过一组级联光谱仪狭缝将可调带传递到传感器。电动屏障由反射镜制成，因此可以将互补部分进一步引导到传感器上。通过这种方式，完整的光谱可以被切割成多个部分，每个部分可以进行微调，以实现通道的最佳分离，而无需进行复杂的计算。这个概念依赖于共聚焦显微镜中发射光束是静止的这一事实。扫描运动通过扫描镜进行补偿，发射的光以相反的方向经过这些镜子。然后，静止的光束通过检测针孔，生成光学切片。

然而，在多光子显微镜中，光学切片是通过光子的非线性相互作用产生的，这种相互作用在焦平面上具有足够的密度。因此，不需要针孔，发射的光可以在通过扫描设备之前被检测到，即非扫描检测。这种方法对于成像深处的浑浊物体（如许多生物样本）尤其重要，因为它们表现出显着的散射，导致光子损失。使用非扫描探测器，收集效率大大提高，图像更加清晰，研究人员可以更深入地观察标本。然而，这一概念没有静态光束，这导致光谱在棱镜和光谱仪狭缝上晃动，从而导致位置依赖的光谱响应。

在瞳孔平面（参见图 3 中的 P），它与显微镜物镜的后焦平面重合，位置是固定的，但角度随着扫描过程不断变化。这个关系被用来方便地扫描样本，而不需要移动标本或光源。扫描镜被放置在与后焦平面共轭的平面中。当扫描时，镜子改变光束角度，这会导致焦平面中的位置变化。

在任何像 G 这样的平面中，位于 F 和 P 之间，角度和位置都随着扫描而变化。

如果我们将梯度滤光片放置在与场共轭的平面中，那么由于变化的位置我们将会有颜色变化。在与瞳孔共轭的平面中，由于变化的角度我们将会有颜色变化。

但是，如果我们将滤光器放在一个合适的位置（图 3 中的位置 G），并且如果我们合理设计滤光器涂层，那么我们可以使这两种效果相互抵消 ^[2]。光束路径和滤光器的设计计算有些繁琐，但最终会得到一个实用的解决方案。这些结果是通过徕卡显微系统的 4Tune 探测器实现的。

图 6： 使用 4Tune 探测器的多光子显微镜拍摄的鼠皮肤切片图像。Lgr5CreERT2-GFP 彩色斑点小鼠的小肠。灰色：SHG 信号（胶原蛋白 1），绿色：Lgr5+干细胞。红色、蓝色和黄色，追踪的细胞是 Lgr5 干细胞的后代。样本由荷兰乌特勒支的 Jacco van Rheenen 提供。